引物 Tm 与属性

Tm_NN 为最近邻热力学法 Tm（推荐参考值），Tm_Wallace（4·GC + 2·AT）只适合 14–20 nt 的短引物粗估，Tm_GC 为经验 GC 公式。含简并碱基的引物会展开成全部具体序列分别计算，Tm_NN 取平均，另一列给出最低–最高（括号内为展开条数）。

Tm 与反应条件有关：请按实际体系填写 Na⁺/K⁺、Mg²⁺、dNTP 与引物浓度。填了 Mg²⁺ 后会按 von Ahsen 2001 折算钠当量；PCR 体系一般 Mg²⁺ 1.5–2.5 mM、引物 200–500 nM，Tm 会比默认条件高几度。

一对引物的 Tm 一般建议相差在 2–3 °C 以内；成对检查默认把相邻两行当作一对（F、R 依次写）。

自身互补、3′ 端互补和发夹只是基于碱基配对的快速提示，不计算二级结构自由能；提示较多的引物建议换位置重新设计。

方法说明

最近邻参数：SantaLucia 1998（PNAS 95:1460）；盐校正：SantaLucia 1998、Owczarzy et al. 2004（Biochemistry 43:3537）、von Ahsen et al. 2001（Clin Chem 47:1956）；Wallace 法：Thein & Wallace 1986。计算结果与 Biopython MeltingTemp.Tm_NN（DNA_NN3）一致。

数据量

最多 500 条引物；建议引物长度 10–60 nt。